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生物检定法与HPLC法测定重组人生长激素(rhGH)效价的相关性验证
作者: 发布于:2016/9/1 14:59:27 点击量:
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   摘要对生长激素的检定和质量控制的重要指标之一是效价测定,其传统经典的方法为在体生物测定法—体重法和胫骨法。随着基因工程技术的发展和质量标准的不断完善,对rhGH的效价测定已用理化分析方法代替生物测定方法。本实验通过对进口和国产的多批rhGH制剂和原料的效价的对比实验,证明生物测定和理化测定的结果基本吻合,具有良好的相关性,为理化测定最终代替生物测定提供了实验依据。
  人生长激素(hGH)过去由人脑垂体提取,其成分不单一,对其检定只能依赖生物测定─去垂体大鼠体重法和去垂体大鼠胫骨法。随着科学的进步,DNA重组生长激素(rhGH)产品日趋成熟,纯度已达95%以上,生产工艺和产品已趋稳定,人们不断研究用简单、快速、灵敏、精确的理化方法代替费时、误差大、损害动物的生物测定。现已载入BP(1993)和EP(1997),并都明确规定必须用适当有效的增进生物生长的方法,来证明生产制造过程中的rhGH产品不得少于2.5IU/mg的生物活性,并由国家卫生行政机构批准执行。在此前提下常规生产中,rhGH的效价测定可用理化方法(HPLC)代替。本文通过对进口和国内生产的多批rhGH制剂和原料的效价进行了生物测定和理化测定,结果表明两法基本吻合,具有良好的相关性,为理化测定最终代替生物测定法提供了实验依据。
  1、材料
  标准品(S):WHO第一次hGH国际标准品IS80/505,4.4IU/amp,生物测定用。WHO第一次rhGH国际标准品IS88/624,3IU/mg,2.0mg/amp,生物测定和理化测定用。
  样品(T):T1—上海细胞所rhGH制剂;T2—Saizen进口rhGH制剂;T3~T5—安徽安科生物高技术有限公司rhGH制剂;T6—安徽安科生物高技术有限公司rhGH原料;T7、T8—永恒生物技术发展(北京)有限公司Met—rhGH制剂。
  去垂体大鼠:清洁级Wistar雄性大鼠(本所动物繁育场),体重60~80g,施去脑垂体手术,恢复2周后使用。
  岛津LC—10AD泵,SPD—10A紫外检测器,CR-7A积分仪,TSK-G2000SW柱(7.8mm×300mm),超纯水器。
  2、方法
  2.1 在体生物测定
  按去垂体大鼠体重法和胫骨法进行,实验设计2×2法,剂距1∶4,高剂量0.1IU/mL,低剂量0.025IU/mL,选择合格去垂体大鼠,随机均匀分组,每组5~10只,每组颈部皮下注射0.5mL一种浓度的S或T,每天注射2次(间隔6h),连续6d,每天同一时间称体重,最后一次给药16h后称重,处死大鼠,计算反应值(净增重)Yi=△bw=bwd-bw0。bwd为最后一次给药(给药4d或6d)16h后大鼠体重;bw0为第一次给药时大鼠体重。
  胫骨法时取上述大鼠胫骨,在胫骨近心端顶部中间沿矢状面切开,硝酸银染色法染色,在倒置显微镜下测定骨骺软骨带宽度(测微尺单位)。
  数据统计:按中国药典1995年版生物统计方法,量反应平行线原理做实验可靠性测验,实验结果可靠者计算效价PT和平均可信限率FL(%)。
  2.2 高效凝胶排阻色谱(SE-HPLC)色谱条件为流动相0.395%碳酸氢铵溶液,流速0.6mL/min,柱温为室温,检测波长为214nm,将S与T分别用流动相配成1.0mg/mL的溶液,进样量20μL。测量S和T的峰面积,计算rhGH效价。
  3、实验结果
  3.1 准确性比较用生物测定法(体重法和胫骨法)与SE-HPLC法测定rhGH进口制剂、国产制剂和原料,rhGH纯度均大于95%(见表1)。由表1可见两种方法有良好的相关性,其相关系数r=0.9028,p<0.01,两种方法间相关有非常显著性意义。两法结果之间虽存在一定偏差(最大偏差21%),由于生物测定误差较大,EP(1987)规定生物测定含量限度为80%~125%,实验误差限度FL为64%~156%,故两法偏差在生物测定本身允许的误差范围内,生物测定的误差可由增加动物数或实验次数来减少,如T1SE-HPLC法的PT=5.5IU/amp,生物测定n=3增至8时合并计算后PT分别为5.9和5.2IU/amp,FL(%)分别为22和12;T3SE-HPLC法的PT=4.6IU/amp,生物测定n=3增至6时合并计算后PT分别为6.3和5.7IU/amp,FL(%)分别为24和21,可见生物测定误差减少后与HPLC所测结果更为接近,偏差减小,两种方法基本吻合。
  3.2 精密度比较我们用生物测定和SE-HPLC多次测定同一样品(T1和T3)。
  4、讨论
  在体生物测定法即去垂体大鼠体重法和胫骨法是测定GH效价法定方法之一,本实验在以前工作的基础上,实验方法更加成熟,因大鼠和实验室均达到清洁级,故大鼠施去垂体手术后,简化抗菌和喂葡萄糖水等步骤,而去垂体大鼠合格率仍能达到60%左右,并且给药期未发现一只大鼠体重下降或死亡。实验成功率达到较高水平。尽管如此,也不可否认生物测定法有费时、费工、伤害动物、去大鼠垂体技术要求高,误差较大等弊病;而理化方法(HPLC法)有精密度高,简单、快捷、灵敏、用样量小等优点,并可分离rhGH活性成分和非活性杂质(hGH二聚体和多聚体),能达到测定rhGH效价的目的,并且与生物测定结果有良好的相关性,两法基本吻合,为理化测定法取代生物测定法提供了十分重要的实验依据。
 

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